A confirmação da presença de material genético (RNA ou DNA) de agentes infecciosos nos fluidos biológicos ou tecidos usando ferramentas de biologia molecular é fundamental para confirmar o diagnóstico. Dessa forma, técnicas moleculares possuem a característica de um diagnóstico direto, diferente de técnicas indiretas como a sorologia. Técnicas tradicionais como isolamentos bacterianos ou mesmo a sorologia continuam sendo importantes, mas a rapidez, especificidade e sensibilidade das técnicas de biologia molecular oferecem ao clínico a possibilidade de identificação precisa e rápida de agentes que são difíceis de serem cultivados. Da mesma forma, um número maior de enfermidades genéticas ou de genes ligados a predisposição de enfermidades tem sido identificado e sua avaliação passou a ser, nos últimos anos, fundamental no diagnóstico diferencial de problemas clínicos ou na seleção de animais para a reprodução, evitando o desenvolvimento de doenças que possam afetar o bem estar e a qualidade de vida da sua progênie. 

A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) foi desenvolvida por Kary Banks Mullis em 1987, o que rendeu seu Nobel de Química em 1993. Esta técnica consiste no princípio de amplificação repetida de uma região de DNA, utilizando primers (iniciadores) específicos para um agente ou região do gene a ser testado, gerando milhares de cópias deste DNA. Deste modo é produzida uma quantidade de material suficiente para as análises desejadas. A PCR parte de três princípios ou três etapas:

DESNATURAÇÃO DO DNA: processo no qual ocorre a separação da dupla fita de DNA devido à quebra das ligações de hidrogênio através de uma alta temperatura (95°C geralmente), deixando como uma fita simples.

ANELAMENTO: onde ocorre a ligação de uma pequena sequência específica de ácidos nucleicos (oligonucleotídeos iniciadores ou primers) para a região que se deseja replicar do DNA. Os primers serão os iniciadores da replicação dessa sequência de interesse. Esse processo de ligação dos primers na fita simples do DNA ocorre a uma temperatura aproximadamente de 60°C.

EXTENSÃO: onde a enzima polimerase vai se ligar a fita de DNA sinalizada pelo primer, iniciando a replicação desse fragmento, formando uma nova fita de DNA (dupla fita) da sequência de interesse. Essa etapa ocorre normalmente a temperatura de 72°C. Essas etapas são realizadas repetidas vezes, por volta de 35 a 45 ciclos, promovendo a amplificação da região de interesse, resultando em milhares de cópias do DNA. 

QUAIS AS DIFERENÇAS ENTRE PCR CONVENCIONAL E qPCR (PCR EM TEMPO REAL) ?

Inicialmente ambas utilizam as três etapas descritas anteriormente. A PCR Convencional demanda etapas extras, pós-PCR, para analisar o produto amplificado. A eletroforese é uma etapa pós-PCR necessária para que ocorra a verificação do produto amplificado. Se trata da separação molecular do produto em um gel de agarose ou de poliacrilamida através de um diferencial de potencial elétrico aplicado. As moléculas de DNA migram de acordo com seu tamanho e peso molecular (as menores migram mais rapidamente). Após essa etapa o gel é corado com um corante específico (um intercalante de DNA) que vai gerar uma fluorescência ao aplicar a luz ultravioleta contra esse gel. Dessa forma pode ser visualizado a formação das bandas ou fragmento de DNA amplificados. Para determinar o tamanho do fragmento de PCR amplificado é utilizado um marcador molecular (que possui bandas de tamanhos conhecidos) como referência para assim avaliar se o produto amplificado na PCR tem o tamanho fragmentos esperado.

Algumas etapas pré-PCR podem ser utilizadas, quando se trabalha com RNA e é necessário fazer a fita complementar (cDNA) usando enzima transcriptase reversa (RT). Dessa forma, temos a conversão do RNA para DNA a fim de submeter aos processos da PCR e da pós-PCR, por conseguinte. Essa técnica é uma derivação da PCR comum e chama-se RT-PCR.

Já a PCR quantitativa (qPCR), ou PCR em Tempo Real, é uma técnica que permite que a amplificação e a detecção do alvo ocorram simultaneamente através de uma fluorescência emitida (utilizando corantes específicos para as reações) durante a reação, não necessitando de outras etapas pós-PCR para obter os resultados. Essa fluorescência é capturada pelo equipamento durante todos os ciclos da PCR, o que permite acompanhar gradativamente todo o processo de replicação do DNA. Essa técnica permite uma detecção 100 vezes melhor do produto em comparação a PCR Convencional. Na qPCR também podemos adicionar a etapa pré-PCR com a transcriptase reversa, denominada RT-qPCR. Desse modo a qPCR ou RT-qPCR garante um resultado mais eficiente na detecção, e mais rápido para as análises e liberação de resultados, uma vez em que elas ocorrem um único procedimento, sem necessidade de manusear as amostras diversas vezes, o que também diminui o viés de contaminação.

AS VANTAGENS DA qPCR E RT-qPCR

Embora a PCR Convencional seja bastante utilizada, há muitas vantagens na utilização da qPCR, algumas até já citadas aqui. Mas de modo geral, podemos elencar algumas delas:

1. A qPCR possui a praticidade do monitoramento em tempo real da reação, podendo acompanhar seu progresso à medida que os ciclos ocorrem e também permite a quantificação dos produtos gerados;

2. A qPCR é mais sensível e específica, resultando uma análise mais precisa e segura;

3. Por ser mais sensível e específica, a qPCR permite detectar quantidade mínimas dos agentes ou patógenos investigados, evitando assim resultados falsos negativos;

4. O tempo de processamento das amostras tanto na qPCR quanto na RT-qPCR é menor, oferecendo um resultado mais eficiente, confiável e muito mais rápido;

5. A qPCR é uma ferramenta de alto valor tecnológico que permite uma detecção de agentes em baixas quantidades, com uma alta sensibilidade, especificidade e precisão no resultado, oferecendo um diagnóstico confiável e rápido.

Nas reações de PCR e qPCR, para se obter um resultado de qualidade e confiável, um dos principais pontos a ser considerado é a qualidade da amostra de DNA e RNA que serão analisadas. Para isso, a extração desse material genético é de suma importância, e para garantir a excelência em nossos diagnósticos contamos com diferentes procedimentos e protocolos de extração de DNA e RNA para os diferentes tipos de patógenos obtendo a melhor qualidade destas amostras. Por exemplo, a extração de DNA de uma amostra de fezes possui um protocolo diferente e mais complexo que a extração de DNA de uma amostra de sangue. Determinados patógenos, por possuírem uma membrana mais resistente, precisam de protocolos de lise mais intensa para que o DNA possa ser liberado para análise.

Nós do LDMVET trabalhamos com kits de extração específicos para amostras de DNA e RNA, para que assim possamos garantir a qualidade e a confiabilidade que sempre almejamos. Dentre os diferentes protocolos para cada extração, garantimos a qualidade em todos os processos envolvidos, sem interferências e contaminações entre as amostras. Contamos com laboratório equipado para as diferentes etapas nos processos de extração, e garantimos um resultado rápido e confiável, que é liberado em até 24 horas após a chegada das amostras em nosso laboratório. Além disso, possuímos uma equipe técnica de profissionais altamente capacitados com nível superior e pós-graduação. Além da qualidade nos processos de extração, envolvida em cada protocolo que realizamos, também é bom salientar que a escolha da melhor amostra para o patógeno investigado é de extrema importância.

CLIQUE AQUI para ter acesso às descrições dos serviços que oferecemos, dos patógenos que investigamos e a descrição das amostras de eleição para cada diagnóstico. Com o envio das amostras de eleição, conforme as orientações, é possível ter resultados mais seguros e confiáveis para o auxílio no diagnóstico do Médico Veterinário.

A colheita correta do material biológico que será enviado para o LDMVET é de extrema importância para o diagnóstico. Essa fase chamada de pré-analítica, ou seja, fase que antecede os processos de análise do material, precisa ocorrer de maneira correta, sem interferências, para garantir um resultado mais seguro e confiável. Alguns fatores que devem ser levados em consideração antes da colheita, pois podem interferir no resultado final, serão também descritos. É fundamental que o clínico avalie qual tipo amostra/material colher para submeter para análise, levando-se em consideração a suspeita clínica, fisiopatogenia da doença e o momento da infecção. Além disso, muitos agentes infecciosos têm predileção por determinados órgãos ou locais para causar a infecção, o que favorece a sua detecção. Quando descrevemos as enfermidades infecciosas apontamos também quais materiais biológicos são os mais indicados para uma análise específica. Todos os resultados dependem das condições prévias da amostra enviada e por isso é fundamental que a mesma esteja em condições adequadas para análise.

CUIDADOS DURANTE A COLHEITA E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS

• IDENTIFICAÇÃO
  Identificar de forma correta e legível a amostra com nome do animal e/ou número da requisição (fornecido pelo sistema online). Procure realizar a identificação em dois lugares diferentes do tubo. Cuidado para utilizar marcadores que não saiam facilmente com umidade ou refrigeração. Muitas vezes amostras de diferentes pacientes são encaminhadas em conjunto e a identificação cuidadosa é fundamental.
   
• VOLUME DA AMOSTRA
  Checar o volume de amostra enviada e verificar o volume mínimo para cada tipo amostral. A amostra enviada no volume adequada permite representatividade amostral, reduzindo a chance de um falso negativo. 
   
• RECIPIENTES ADEQUADOS 
  Garantir que o tubo ou recipiente seja adequado ao tipo de material colhido, bem como, garantir que tal material não vazará durante o transporte. Para todo tipo de material é necessário, no mínimo, uma vedação suplementar, pois durante o transporte o recipiente pode permanecer parte do tempo na posição horizontal propiciando vazamentos, se não estiver bem vedado.
   
• CONTAMINAÇÃO
  As amostras devem ser devidamente manipuladas e evitar contaminação ambiental, do manipulador e entre amostras enviadas. Nesse caso, um recipiente adequado e bem lacrado novamente se mostra essencial.
   
• TEMPO DE COLHEITA E ARMAZENAMENTO
  A amostra deve ser preservada desde o momento da colheita até a sua análise, sob refrigeração (entre 2 e 8ºC - temperatura de geladeira) até o dia do envio, que deve ser realizado em até 7 dias pós-colheita. Algumas análises podem ser realizadas após o período de 7 dias, especialmente testes genéticos realizados a partir de DNA e serão detalhados a seguir.
   
• ENVIO
  O envio deve ser feito sob refrigeração (com gelo reciclável), pelos Correios ou por transportadora ou mesmo entregue pessoalmente no laboratório

1. SANGUE TOTAL: a amostra de sangue total deve ser colhida por um Médico Veterinário de forma semelhante à realizada para envio de exames de hemograma. O sangue, colhido em tubo estéril com EDTA, e preferencialmente sem coágulos.
   • Volume: mínimo de 0,5 mL; Ideal de 1 a 2 ml.
   • Acondicionamento: tubo estéril contendo EDTA (tampa roxa).
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8ºC - temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
2. URINA: a colheita da amostra de urina deve ser realizada por um Médico Veterinário de forma semelhante à de exames de urinálise. A amostra pode ser de micção espontânea, cistocentese ou sonda uretral.
   • Volume: mínimo de 1 mL; Ideal de 2 a 3 mL.
   • Aconcionamento: tubo estéril sem anticoagulante (ex: tubo falcon, microtubo eppendorf - vedar bem a tampa com auxílio de uma fita adesiva para evitar o vazamento). Não enviar a amostra em seringa ou coletor universal, pois existe grande possibilidade de vazamento durante o envio
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8º C - temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
3. FEZES OU SWAB RETAL:
   • Volume: mínimo de 2 gramas ou 2 mL se estiver líquida. 
   • Aconcionamento: frasco coletor universal para fezes. Para o swab, sem meio de transporte, em tubo estéril sem anticoagulante ou em frasco coletor universal.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8º C- temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
4. SWAB (ORAL, NASAL, CONJUNTIVAL): ao obter o swab procure ter certeza de que boa quantidade de material foi obtida, pois amostras contendo pequena quantidade de material biológico podem acarretar resultados falso negativos. Observação: o swab utilizado para biologia molecular é diferente do swab para cultivos microbianos, ou seja, para realizar a PCR ou qPCR a amostra deve ser colhida em swabs sem o meio de transporte.
   • Volume: mínimo de 1 swab.
   • Aconcionamento: sem meio de transporte, em tubo estéril sem anticoagulante ou em frasco coletor universal.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8º C- temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
5. LÍQUOR:
   • Volume: mínimo de 0,5 mL, Ideal de 1 a 2 mL.
   • Aconcionamento: tubo estéril sem anticoagulante.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8ºC - temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita
      
6. MEDULA ÓSSEA COM EDTA:​
   • Volume: mínimo de 0,5 mL.
   • Aconcionamento: tubo estéril contendo EDTA.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8ºC - temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
7. ASPIRADO DE LINFONODO:
   • Volume: mínimo de 0,5 mL.
   • Aconcionamento: tubo estéril sem anticoagulante.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8ºC - temperatura de geladeira).
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.
      
8. LÍQUIDOS CAVITÁRIOS (EFUSÃO ABDOMINAL/TORÁCICA):
   • Volume: mínimo de 0,5 mL. Ideal de 1 a 2 mL.
   • Aconcionamento: tubo estéril contendo EDTA.
   • Conservação: sob refrigeração (entre 2 e 8º C temperatura de geladeira).
   • Aconcionamento: tubo estéril contendo EDTA.
      
9. FRAGMENTOS DE ÓRGÃOS/TECIDOS:.
   • Volume: mínimo de 300 mg por órgão/tecido sendo o ideal 1 cm3. Biópsias de pele realizadas com punch de 0,5 cm também são suficientes para a realização dos exames.
   • Aconcionamento: frasco coletor estéril sem adição de formol.
   • Conservação: congelado
   • Envio: em até 7 dias após a colheita.

Recebido o resultado do exame: como interpretar? Lembramos que o resultado de cada exame deve ser analisado associando a apresentação clínica do paciente, histórico de exames, tratamentos e doenças anteriores.

- POSITIVO: Presença do material genético (DNA ou RNA) do patógeno na amostra analisada.

- NEGATIVO: Ausência do material genético (DNA ou RNA) do patógeno na amostra analisada.

Lembramos que o resultado negativo não exclui a possibilidade do animal estar infectado. Alguns fatores precisam ser considerados, como por exemplo:

(I) FASE DA DOENÇA
Infecção inicial ou final onde a concentração do agente pode estar muito baixa, não sendo detectado no exame, mesmo sendo uma técnica altamente sensível; 

(II) TIPO DE AMOSTRA QUE FOI ENVIADA
Para cada agente, baseado nas características da doença, há amostras que são mais sensíveis e então aumentam as chances do agente estar presente, e outras que são menos sensíveis, variando a carga e presença do patógeno durante a infecção;

(III) O ANIMAL ESTAR SOB TRATAMENTO E GERAR RESULTADOS FALSOS-NEGATIVOS.

- INCONCLUSIVO: Não foi possível determinar presença ou ausência do material genético do patógeno na amostra analisada. Há uma amplificação no teste, mas com valores fora do ponto de segurança estabelecido. O resultado inconclusivo pode ocorrer devido a alguns fatores, como: fase da doença (infecção inicial ou final onde a concentração do agente pode estar muito baixa, sendo detectado no exame, mas fora do ponto de corte); animal sob tratamento (o agente pode ainda estar presente, mas em baixa concentração); uso de vacina atenuada recente. Nossa equipe está à disposição para auxiliar o clínico na interpretação dos resultados em caso de necessidade.

As doenças genéticas são causadas por alterações no material genético do indivíduo, principalmente no seu DNA, chamadas de mutações. A maioria das doenças genéticas é hereditária, e como o próprio nome sugere, é passada dos pais aos filhos. Os animais domésticos possuem duas cópias de DNA, uma cópia herdada do seu pai e outra da sua mãe. Sendo assim, se um indivíduo possui uma cópia, ou duas, de DNA com uma mutação, pode ou não apresentar os sinais da doença genética dependendo se a enfermidade é autossômica recessiva ou dominante e também passar uma cópia com a mutação para seus descendentes.

Quando apenas uma cópia de DNA com a mutação, seja ela herdada do pai ou da mãe, é suficiente para manifestar a doença, ela é denominada de Dominante. Uma enfermidade é denominada de Recessiva, quando duas cópias do gene são necessárias para ocorrer a doença. Nesses casos, animais com apenas uma cópia de DNA mutada são chamados de portadores ou carreadores, e embora não manifestem a doença podem passar essa cópia para seus descendentes. O filho de dois animais portadores de uma determinada mutação, pode herdar uma cópia afetada de cada um dos pais, e dessa forma manifestar a doença recessiva. Em cada quatro animais nascidos de pais portadores, um deles provavelmente será afetado.

Por serem doenças hereditárias, que passam de pai para filho, testar os pais é uma forma eficiente para melhorar o planejamento reprodutivo. Conhecendo se os reprodutores possuem ou não cópias anormais do material genético, relacionadas a alguma destas doenças, pode-se selecionar os acasalamentos para prevenir a ocorrência de animais doentes e minimizar os prejuízos.

Testes moleculares para diagnóstico de enfermidades genéticas são ferramentas que permitem identificar alterações ou mutações em um determinado gene presente no DNA. Essas mutações podem alterar a atividade celular no organismo do indivíduo e consequentemente levar a doença. O teste molecular genético, emprega a técnica de PCR, em que é gerado um grande número de cópias da região do gene alvo onde localiza-se a mutação. Em seguida, utilizando uma das formas mais precisas de análise, esse fragmento de DNA amplificado é submetido ao sequenciamento de DNA automatizado, utilizando a técnica de Sanger. Em seguida, essa sequência é analisada, para confirmar se houve uma alteração na sequência e posição desses nucleotídeos que indicam a mutação genética. A análise do sequenciamento do fragmento de DNA relacionado ao gene mutante, também pode revelar se indivíduos progenitores podem passar essa anomalia genética para a sua progênie, ou seja, se a mutação genética tem potencial hereditário. Dessa forma, pode-se evitar a reprodução de animais com determinada condição genética que podem favorecer o desenvolvimento de doenças, que muitas vezes não possuem tratamento, e ainda se perpetuar numa ninhada ou rebanho.

A colheita correta do material biológico que será enviado para o LDMVET é de extrema importância para o diagnóstico da amostra que será analisada. Essa fase chamada de pré-analítica, ou seja, fase que antecede os processos de análise do material, precisa ocorrer de maneira correta, sem interferências, para garantir um resultado mais seguro e confiável. A equipe do LDMVET está a disposição para ajudar na interpretação dos resultados e em caso de necessidade montar um teste genético para a enfermidade que o Médico Veterinário está avaliando, portanto, em caso de dúvida entre em contato com nossos especialistas.

CLIQUE AQUI para conferir nossos Testes Genéticos para Enfermidades Hereditárias

Para testes genéticos em cães é possível encaminhar amostra de sangue total ou esfregaço oral (bochecha). Para gatos é recomendado o envio de sangue total.

- A amostra de sangue total com EDTA (tubo com tampa roxa) deve ter no mínimo 1mL e ser conservada em geladeira da colheita até o transporte, podendo ser armazenada dessa forma por até 10 dias antes do exame. 

- Para coletar esfregaço bucal, deve-se swab ou escova cervical (recomenda-se pelo menos 3 swabs ou escovas de amostra por animal). Este esfregaço é a coleta de células da bochecha interna do animal, devendo esfregar pelo menos 10 vezes a escova na face interna da bochecha, sendo que o animal precisa estar em jejum de 3 horas e sem contato outros animais (para evitar mordidas e lambeduras que possam contaminar o material com o DNA de outro cachorro). De preferência o swab não deve ser passado na gengiva, dentes ou língua, apenas na bochecha, de modo a coletar as células de descamação da mesma. Swabs orais não são recomendados para filhotes em amamentação por conter muitas células da mucosa mamária da mãe na boca (recomenda-se apenas sangue total nesse caso). Esse material deve ser encaminhado no mesmo dia da coleta e ser processado em até 4 dias pelo laboratório, devido a chance de contaminação bacteriana (microbiota oral do animal) que reduz a quantidade de DNA extraído do animal em detrimento da alta quantidade de DNA bacteriano. A conservação em geladeira (4°C) auxilia a evitar a multiplicação bacteriana caso o prazo seja maior que esse (não pode ultrapassar 7 dias para a análise).

O veterinário será o responsável por coletar, solicitar e assinar o pedido de exame, corroborando que a amostra enviada refere-se ao animal especificado na requisição (conforme estabelecido pelo CFMV Resolução n.1374/2020).

Para solicitar o exame, CLIQUE AQUI e se cadastre, criando LOGIN e SENHA. Na área do cliente do site, entre em SOLICITAR TESTE GENÉTICO e insira os dados solicitados para a requisição: Nome do animal - ID microchip (opcional) - Número de registro/RG (opcional) - Sexo - Espécie - Raça - Pelagem - Data de nascimento - Data de coleta - Proprietário - Amostra coletada - Exame solicitado. O sistema gera uma requisição em PDF que deve ser impressa, carimbada e assinada pelo veterinário solicitante e encaminhada junto com a amostra.

Mais informações para o envio da amostra ao laboratório, CLIQUE AQUI.

Para testes genéticos de equinos, como HERDA, HYPP, HM, GBED, IMM, dentre outros, solicitamos o envio de amostras de bulbos da crina ou cauda ou de sangue total.

- A amostra de sangue total com EDTA (tubo com tampa roxa) deve ter no mínimo 1mL e ser conservada em geladeira da colheita até o transporte, podendo ser armazenada dessa forma por até 10 dias antes do exame. O transporte pode ser realizado a temperatura ambiente dentro de um prazo de 7 dias. Mais que isso solicitamos manter a amostra refrigerada. O tubo contendo a amostra deve ser bem fechado para evitar vazamento e contaminação. Além disso, no tubo deverá conter a identificação do respectivo animal. Não devem ser enviadas amostras de plasma, soro e sangue coagulados para a realização do teste.

- As amostras de pelo para teste molecular genético devem conter o bulbo piloso, sendo necessário pelo menos 30 fios e todos fios devem ser do mesmo animal. Colha material de um animal por vez. Remova os pelos velhos ou soltos da área a ser colhida, com auxílio de um pente ou escova. Os pelos devem estar limpos e secos, durante a colheita. Para adultos, colha da cauda ou crina (acima da cernelha) e em potros prefira os fios da cauda, pois os pelos da crina tende a ser mais finos e os folículos tendem a ser menores. Obtenha amostras de pelos por avulsão manual. Para isso, segure de 5 a 10 fios enrolando os pelos em volta do dedo, próximo à pele e puxe de maneira rápida e uniforme, no sentido do crescimento do pelo. Obtenha mais de 30 fios com a raiz para o teste. O DNA está contido no bulbo piloso por isso, essa parte do pelo deve permanecer preservada. Verifique se os fios não se separaram do bulbo. O excesso de pelo pode ser cortado mantendo um comprimento de aproximadamente 5 cm. Cuidado para não descartar a região com o bulbo. Os pelos colhidos poderão ser colocados em envelope de papel individual, contendo a identificação do nome do animal, nome do veterinário requisitante e número do pedido de exame gerado no sistema (CLIQUE AQUI para entrar no sistema e verificar a requisição do pedido).